Western Blots

 

Monoklonaler Anti-c-myc von Boehringer (#1667149)

1.    Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,1% Tween 20: 30 min schütteln lassen

2.    Waschen: 2x 2 min PBS def./0,1% Tween 20

3.    Inkubation mit 1. Antikörper:  monocl. anti-c-myc 1:200 in PBS def./0,1% Tween 20 

2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren

4.    Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

5.    Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 931, 

Batch 133232 ) in PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

6.    Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit PBS def./0,1% Tween 20

7.    Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren

8.    Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager

Polyklonaler Anti-c-myc Tag 409-420(cat#06-549/Lot#14966)

1.   Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,1% Tween 20: 30 min schütteln lassen

2.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

3.   Inkubation mit 1. Antikörper:  polykl. anti-c-myc 1:1000 in 1x PBS def./0,1% Tween

20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren

4.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

5.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 934, 

Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

6.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

7.   Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren

8.   Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager

 

Anti-X-Press  (#46-0528/Lot#800969)

1.   Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,1% Tween 20: 30 min schütteln lassen     Johannes A. Schmid           

2.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

3.   Inkubation mit 1. Antikörper:  anti-X-Press 1:5000 in 0,1% BSA /1x PBS def./0,1%

Tween 20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren

4.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

5.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 931, 

Batch 133232 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

6.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

7.  Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2

 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren, Exponieren auf Film, bzw. Detektion am

LumiImager

  Monoklonaler Anti-P-Tag (H902-ascites) 

1.   Blocken mit 2% Magermilch / 1x PBS def.-0,05% Tween 20: 30 min schütteln lassen

2.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween 20

3.   Inkubation mit 1. Antikörper:  monocl. anti-P-Tag 1:2000 in 0,2% Trockenmilch/1x

PBS def./0,05% Tween 20 

über Nacht bei 4 ° C inkubieren (1:1000 verdünnen, wenn man 1 Std. bei RT

inkubiert)

4.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween 20

5.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 931, 

Batch 133232 ) in 1x PBS def./0,05% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

6.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween 20

7.   Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren

8.   Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager

 

Polyklonaler Anti-Flag von Santa Cruz (D-8/ cat#sc807/Lot#B057)

1.   Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,1% Tween 20: 30 min schütteln lassen     Johannes A. Schmid           

2.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

3.   Inkubation mit 1. Antikörper:  polykl. anti-Flag 1:1000 in 1x PBS def./0,1% Tween

20 

1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren

4.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

5.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 934, 

Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

6.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

7.   Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren

8.   Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager
 

M1 Monoklonaler Anti-FLAG M1 von Kodak (cat#13001) 

1.   Blocken mit 5% Magermilch/50 mM Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mM NaCl(40

ml 

5 M NaCl)+ 2 mM CaCl 2     (2 ml 2 M CaCl 2   ) 1 Stunde schütteln lassen

2.   Waschen: 3x kurz 50 mM Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mM NaCl(40 ml 5 M

NaCl)+ 2 mM CaCl 2     (2 ml 2 M CaCl 2   )

3.   Inkubation mit 1. Antikörper:  monocl. M1 anti-Flag  1:500 in 50 mM Tris(50 ml 1 M

Tris bei 1l)+ 200 mM NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mM CaCl 2     (2 ml 2 M CaCl 2   ) 

Inkubation 1 Stunde bei R.T.

4.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 50 mM Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 

200 mM NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mM CaCl 2     (2 ml 2 M CaCl 2   )

5.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 931, 

Batch 133232 ) in 50 mM Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mM NaCl(40 ml 5 M

NaCl)+ 2 mM CaCl 2     (2 ml 2 M CaCl 2   ) 1 Stunde bei R.T.

6.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 50 mM Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 

200 mM NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mM CaCl 2     (2 ml 2 M CaCl 2   )     Johannes A. Schmid           

7.  Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren, Exponieren auf Film, bzw. Detektion am

LumiImager

 

Polyklonaler Anti-IKBα  (C-21/cat#sc-371/Lot#A058)

1.   Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,1% Tween 20: 30 min schütteln lassen

2.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

3.   Inkubation mit 1. Antikörper:  polykl. anti-IKB- α  1:500 in 1x PBS def./0,1% Tween

20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren

4.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

5.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 934, 

Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

6.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

7.   Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren

8.   Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager

Polyklonaler Anti-Traf-1  (H-186/cat#sc-7186/Lot#Do18)

Polyklonaler Anti-Traf-2  (H-249/cat#sc-7187/Lot#Do88)

1.   Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,05% Tween 20: 30 min schütteln lassen

2.   Inkubation mit 1. Antikörper:  polykl.cl. anti-Traf 1/2 1:500 in 5% Magermilch/1x

PBS def./0,05% Tween 20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C

inkubieren

3.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween 20

4.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 934, 

Batch 103 ) in 1x PBS def./0,05% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

5.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween 20

6.   Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren     Johannes A. Schmid           

 

Anti-HA-HRP-konjugiert  (Böehringer cat#1667475)

1.   Blocken mit 1% BSA / 50 mM Tris/ 200 mM NaCl/ 0,1% Tween 20: 1 Stunde

schütteln 

2.   Inkubation mit 1. Antikörper:   anti-HA-HRP 1:1000  in 1% BSA / 50 mM Tris/ 200

mM NaCl/ 0,1% Tween 20, 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C

inkub. 

3.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 50 mM Tris/ 200 mM NaCl/

 0,1% Tween 20

4.   Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren

5.   Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager

Anti-myc-HRP conjugated (Invitrogen, #46-0709)

1.   Block: 5% dry milk in TBS

2.   Wash 2x 5 min with TBS/0.05% Tween-20 (TBS/T)

3.   Antibody: anti-myc-HRP (1:2000 in blocking buffer): 2 h at r.t. or over night at 4°C

4.   Wash 2x 5 min with TBS/T

5.   Wash once for 5 min with TBS

6.   Detection with Pierce SuperSignal or equivalent

Anti-TAK1 (Santa Cruz, rabbit polyclonal, #sc-7162, Lot: J227)

1.   Block: 30 min with 5% dry milk in TBS (or PBS)

2.   Wash briefly with TBS

3.   1st antibody: anti-TAK1 (1:500 or 1:1000 in TBS): 1 h at r.t. or over night at 4°C

4.   Wash 3 x 5 min with TBS/0.05% Tween-20

5.   2nd antibody: anti-rabbit-Ig-HRP 1:5000 in TBS/T (Amersham NA 934): 1 h at r.t.

6.   Wash 3 x 5 min with TBS/0.05% Tween-20

7.   Detection with Pierce SuperSignal or equivalent    

Anti-FLAG (M2): Monoclonal mouse ab, Sigma F3165, Lot: 68H9255

1.   Block with 5% dry milk in TBS (1 h at 37°C) 

2.   Wash 2x 2 min with TBS

3.   1st antibody: anti-flag M2 (1:1000 in TBS or in blocking buffer): 30 min – 1 h at r.t.

4.   Wash 3x 2 min with TBS

5.   2nd antibody: anti-mouse-Ig-HRP (1:5000 in TBS or blocking b., Amersham NA931)

30 min – 1 h at r.t.

6.   Wash 3x 15 min with TBS

7.   Detection with Pierce SuperSignal …

Polyklonaler Anti-GFP (Clontech.cat#8363-1)

1.   Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,1% Tween 20: 30 min schütteln lassen

2.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

3.   Inkubation mit 1. Antikörper:  polykl. anti-GFP 1:1000 in 1x PBS def./0,1% Tween-

20 , 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren

4.   Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

5.   Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-Ig-HRP 1:5000 (Amersham NA 934, 

Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T.

6.   Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,1% Tween 20

7.   Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm2 Blot , 2 Lösungen im

Verhältnis 1:1 gemischt: 5 min inkubieren

Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager     

Anti-Phospho-p38

1.   Block: 3% milk in PBS/0.1%Tween 20 (PBS/T): 30 min

2.   1st antibody (New England Biolab, Diana Mechtcheriakova) 1:1000 in Block: 1 h at RT

3.   Wash: 3x 5 min in PBS/T

4.   2nd antibody: anti-rabbit Ig-HRP 1: 2500 (Amersham): 1 h at r.t.

5.   Wash: 3x 5 min in PBS/T

6.   Detection with Pierce SuperSignal or equivalent